Вы здесь

Методы обнаружения микобактерий туберкулеза

Общие свойства мокроты и ее микроскопия. До того как мокрота будет исследована на наличие микобактерий, лаборант по ее внешнему виду определяет количество, запах, цвет, консистенцию, характер. Жидкую мокроту, состоящую из гнойных клеток, определяют как гнойную; мокроту с преобладанием гноя или слизи — как гнойно-слизистую или сли-зисто-гнойную; мокроту без гноя, содержащую только слизь, как слизистую, содержащую только кровь,— как кровянистую, а с примесью слизи и гноя — как кровянисто-слизисто-гнойную.

По консистенции мокрота может быть тягучей, студенистой, умеренно вязкой, жидкой.

В мокроте могут быть примеси, заметные невооруженным глазом: фибринозные слепки бронхов, кусочки ткани, бело-желтоватые комочки (дитриховские пробки), зерна «чечевицы» или «линзы» из омертвевшей ткани, детрита эластических волокон, беловатые полоски, свидетельствующие об обызвествленном распаде, пленчатые образования (эхинококк) и другие включения.



Далее под микроскопом исследуют нативный препарат мокроты, для чего готовят 2 препарата на одном предметном стекле и накрывают двумя покровными стеклами. Исследование проводят при малом увеличении (объектив 10, окуляр 7) и с объектом 40.

В нативном препарате определяют наличие лейкоцитов, эозинофилов, эритроцитов, клеток эпителия, эластических и других видов волокон и прочих элементов.

Для диагностики туберкулеза большое значение имеет обнаружение в препарате эластических волокон, присутствие которых указывает на разрушение ткани. Эластические волокна в мокроте могут быть и при других заболеваниях (например, при абсцессе легких, новообразованиях, эхинокок-козе и др.). Под микроскопом эластические волокна имеют вид длинных, блестящих волокнистых образований равномерной толщины.

При наличии каверны эластические волокна покрываются мылами и приобретают вид кораллов. Коралловидные волокна образуются при наличии в каверне жира, солей кальция и магния, образующих мыла, которые и покрывают эластические волокна. Если в мокроту добавить 10 % раствор едкой щелочи, то мыла очищаются и выявляются обычные эластические волокна.

Большое диагностическое и прогностическое значение имеет выявление в препарате так называемой тетрады Эрлиха, в которую входят следующие элементы:

  • 1) обызвествленные эластические волокна,
  • 2) обызвествленные частицы жирового распада,
  • 3) кристаллы холестерина,
  • 4) измененные микобактерии туберкулеза.

Такие элементы в мокроте наблюдаются при распаде старых обызвествленных очагов.

Методы обнаружения и выделения возбудителя туберкулеза. Наиболее надежным подтверждением диагноза туберкулеза является обнаружение возбудителя в выделениях больного или взятых из организма материалах.

Основным материалом для исследования является мокрота. При отсутствии мокроты исследуют слизь из гортани или промывные воды бронхов, иногда — промывные воды желудка. Исследованию подлежат также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из плевральной полости, ас-цитическая жидкость, пунктат из закрытых натечников. При необходимости исследуют кусочки тканей или органов, взятые у больных во время операции. Материал для исследования должен быть взят с соблюдением правил асептики.

Результаты исследований во многом зависят от правильности сбора материала, его обработки и хранения. Важное значение имеет и правильное приготовление мазков или материала для посева на питательные среды.

Для обнаружения МТ в выделениях больного применяют бактериоскопический (микроскопия мазков), бактериологический (посев материала на питательные среды) и биологический (заражение лабораторных животных) методы.

Сбор и подготовка материала для исследования.

Мокрота. Следует собирать утренние порции мокроты и исследовать ее в тот же день. Если у больного мало мокроты, то ее собирают в течение дня (суточная мокрота). Для усиления секреции мокроты применяют раздражающую аэрозольную ингаляцию, для чего используют аэрозольный ингалятор типа АИ-1. Для ингаляции рекомендуется 15 % раствор натрия хлорида в 1 % растворе натрия гидрокарбоната. Ингалируют 30—60 мл раствора, нагретого до 42—45 °С. Индивидуальные мерные стаканчики и мундштуки подлежат дезинфекции. При отсутствии мокроты у больных получают промывные воды бронхов. У детей чаще исследуют промывные воды желудка, так как они плохо откашливают мокроту и заглатывают ее.

Лучше исследование мокроты проводить до начала лечения ежедневно в течение 3 дней подряд. Объяснить больному, что он должен собирать не носоглоточную слизь и слюну, а отделяемое из верхних дыхательных путей при кашле.

Перед сбором мокроты больной должен прополоскать рот и зев кипяченой водой. Мокрота должна быть собрана в стерильную плевательницу. Промывные воды бронхов получает врач-ларинголог. Для микроскопии и посева используют осадок, полученный при центрифугировании промывных вод.

Моча. В мочу могут попасть непатогенные микобактерии смегмы, которые имеют морфологическое сходство с мико-бактериями туберкулеза. Поэтому перед взятием мочи необходим тщательный туалет наружных половых органов. Утреннюю мочу следует брать стерильным катетером в стерильную посуду. Если результат утренней порции мочи отрицателен, то 2—3 дня подряд берут суточную порцию мочи, которую отстаивают в течение ночи, верхний слой сливают, а остаток центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. Осадок используют для приготовления мазка и посева.

Кал. В хлопьях слизи и гноя можно обнаружить микобактерии туберкулеза (методом бактериоскопии и посева).

Спинномозговая жидкость. Ее оставляют на сутки при комнатной температуре. На поверхности жидкости образуется фибринозная пленка, из которой и делают мазок на стекле. При отсутствии пленки жидкость центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 мин, после чего ее сливают, а из осадка делают мазок.

Бактериоскопия (микроскопия) мазков. Микроскопическое исследование мазков является наиболее простым, доступным, дешевым и быстрым методом обнаружения микобактерий. Он остается одним из основных методов исследования.



Недостатком прямой бактериоскопии окрашенных мазков является низкая чувствительность метода. При микроскопии можно обнаружить М'Г в мокроте, если в 1 мл мокроты содержится не менее 10000—100000 палочек. В настоящее время под влиянием химиотерапии количество микробов в мокроте значительно снижается, что создает дополнительные трудности в выявлении возбудителя. В связи с этим в повседневной практике работы широко применяют методы обогащения и накопления микобактерий, которые позволяют концентрировать возбудителей туберкулеза в небольшом объеме материала. Совершенствуются и сами методы бактериоскопии и выделения возбудителя.

Мазки для микроскопии готовят из любого материала, полученного от больного (мокрота, кал, моча, плевральный экссудат, гной, спинномозговая жидкость).

Приготовление мазков из мокроты. Мокроту выливают в чашку Петри, под которую подкладывают лист черной бумаги, на фоне последней хорошо заметны жел-тогнойные комочки, которые и следует отбирать. Гнойные комочки деревянными заостренными палочками переносят на предметное стекло. Мазок готовят путем растирания комочков между 2 стеклами. Затем мазок высушивают на воздухе, фиксируют путем проведения мазка через пламя горелки и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Окраска мазка по Цилю-Нильсену. На мазок наливают основной фуксин Циля и подогревают его до появления пара. После остывания мазка краску сливают и мазок промывают водопроводной водой, обесцвечивают 10—15 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта до появления бледно-розового цвета и после этого снова промывают водой. Затем мазок докрашивают 0,5 % раствором метиленового синего в течение 1/2 мин. Мазок промывают водой и высушивают.

На мазок наносят каплю кедрового масла и микроско-пируют. Микобактерии под микроскопом окрашены в рубиново-красный цвет в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек и располагаются единично или небольшими группами на сине-голубом фоне, в который окрашены вещество мокроты и различные клетки. При лечении химиопрепаратами микобактерии часто приобретают вид толстых и грубых палочек, похожих на кокки, и имеют более светлую окраску.

Бактериоскопия дает приблизительно на 10 % больше положительных результатов при использовании метода флотации, позволяющего в 5—10 раз увеличить концентрацию микобактерий.

Метод флотации заключается в том, что бензин, бензол, ксилол, толуол и другие углеводороды легче воды, добавленные в мокроту с водой, при встряхивании разбиваются на мельчайшие капельки, которые, поднимаясь кверху, адсорбируют на себе микобактерии.

В банку объемом 250 мл со стеклянными бусами вносят 10—15 мл мокроты (или другого исследуемого материала — кал, осадок мочи, экссудата и др.), добавляют примерно равное количество 0,5—1 % раствора едкого натра и встряхивают до полного разжижения мокроты. Затем добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5—1 мл любого углеводорода и встряхивают в течение 5—10 мин. После этого в бутылку добавляют дистиллированной воды до горлышка и оставляют при комнатной температуре на 30—60 мин. На поверхности появляется беловатое пенистое флотационное кольцо, которое отсасывают пастеровской пипеткой с резиновым баллончиком и наносят на предметное стекло. По мере подсыхания капли на нее наносится новая порция. Наслаивание после подсыхания проводится 4—5 раз. После этого мазок фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Для концентрации возбудителя широко применяют также метод седиментации (осаждения). К мокроте прибавляют равный объем 10 % раствора натрия фосфата, который является хорошим гомогенизатором мокроты, не нарушает жизнедеятельность микобактерий и в то же время угнетает рост сопутствующей микрофлоры. После добавления натрия фосфата смесь инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч, затем центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость потом сливают, а осадок используют как для посева, так и для микроскопии.

Более чувствительной является люминесцентная микроскопия, которая на 20—30 % по сравнению с обычной увеличивает положительный результат. Этот метод основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные краски, которые светятся при облучении их короткими синими или ультрафиолетовыми лучами. Светящиеся микобактерии хорошо видны. Мазок можно просматривать при малом увеличении гораздо быстрее, чем при объективе с иммерсией. Мазок готовят как обычно, фиксируют смесью Никифорова и пропитывают специальными красителями (флюорохромами): аурамином в разведении 1:1000 или родамином С. Затем мазок обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают кислым фуксином. Под микроскопом микобактерии светятся на темном фоне ярким золотисто-зеленым цветом. Микроскопию проводят в люминесцентном микроскопе или на обычном с опакиллюминатором (насадкой), пропускающим короткие синие и ультрафиолетовые лучи.

Недостаток метода микроскопии состоит в том, что он не позволяет безусловно дифференцировать патогенные и непатогенные микобактерии. С целью ориентировочной дифференциации патогенных и непатогенных микобактерий при микроскопии используют более длительное обесцвечивание мазков кислотой или спиртом. Сапрофиты после этого частично или полностью обесцвечиваются, а патогенные микобактерии удерживают окраску.

В последние годы появилась возможность отличать в мазках живые и мертвые микобактерии, что может служить дополнительным важным критерием оценки эффективности лечения. Суть метода состоит в том, что дезоксирибонуклеи-новая кислота (ДНК) живых микобактерий воспринимает окраску метиленовым зеленым, а у мертвых ДНК этой окраской не окрашивается. В то же время ДНК мертвых микобактерий может окрашиваться дополнительными красителями: пиронином, сафронином или карболовым фуксином.

Возбудитель туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis

Наиболее надежным, достоверным и чувствительным методом диагностики туберкулеза является метод выделения чистой культуры микобактерий (бактериологический). Этот метод позволяет выявить микобактерии при содержании 20—100 возбудителей в исследуемом материале, увеличивает положительный результат на 15—30 %. Выделенную культуру можно изучить, дифференцировать от непатогенных микобактерий, определить ее вирулентность и устойчивость возбудителя к лечебным препаратам. Недостатками бактериологического метода являются сложность обработки материала и длительный рост возбудителя на средах.



Засеваемый материал гомогенизируют и одновременно обрабатывают серной или соляной 6 % кислотой или 4—6 % раствором едкого натра для уничтожения посторонней микрофлоры. Осадок после центрифугирования служит материалом для посева. Посев производят на яичную среду Левенштейна-Йенсена, которая рекомендована Всемирной организацией здравоохранения в качестве стандартной среды. Посев материала делают в 5 пробирок. При обработке материала серной кислотой вся процедура подготовки для посева должна быть выполнена быстро — в пределах 15 мин, так как более длительная экспозиция в кислоте снижает способность микобактерий к росту. Микобактерии вырастают на среде на 15—25-й день после посева. Жидкие материалы (моча, ликвор, экссудат, промывные воды желудка и бронхов) перед посевом необходимо центрифугировать и для устранения посторонней микрофлоры обработать осадок 3 % раствором серной кислоты в течение 20 мин. После этого обработанный кислотой материал повторно центрифугируют, а осадок используют для посева на среду. Ликвор, полученный стерильно, засевают без обработки кислотой.

Можно делать также посев мазка из гортани. Мазок берут ватным тампоном с надгортанника под контролем гортанного зеркала. Тампон помещают в небольшой объем 3—5 % раствора серной кислоты, отжимают его, а раствор центрифугируют. Осадок засевают на среду.

Иногда пользуются ускоренными методами посевов, из которых наиболее известен метод Прайса. Этот метод состоит в том, что подсушенный мазок мокроты после обработки его в серной кислоте и промывания погружают в пробирки с кровяной средой на 7—10 дней. Затем мазок промывают, сушат, фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Применение для обработки мокроты поверхностно-активных веществ (лаурилсульфат; лауросепт и др.) значительно увеличивает рост микобактерий.

Для посева патологического материала используют плотные, полужидкие и жидкие питательные среды, но ни одна из них не обладает всеми необходимыми качествами. Поэтому посев делают на 2—3 различные среды. Чистые культуры выделяют на плотных, полужидких яичных и агаровых средах.

В настоящее время обязательно определение устойчивости микобактерий к стрептомицину, тубазиду и ПАСКу (парааминосалициловая кислота). С этой целью готовят набор сред Левенштейна с тремя разными концентрациями каждого препарата. Микобактерии, которые растут при концентрации 10 мкг/мл и более стрептомицина и ПАСКа и при концентрации 1 мкг/мл и более тубазида, считаются лекарственно-устойчивыми.

Большое значение в микробиологической диагностике туберкулеза имеет определение количества микобактерий в исследуемом материале для оценки тяжести процесса, тактики лечения и его эффективности.

Биологический метод исследования основан на заражении патологическим материалом морских свинок, которые очень чувствительны к туберкулезной инфекции. Этот метод признается более чувствительным для обнаружения микобактерий. Появление измененных под влиянием химиотерапии микобактерий иногда дает отрицательные результаты заражения животных при положительных результатах посева на среды. Это происходит в результате значительного снижения или полной утраты микобактериями вирулентности. С целью повышения количества положительных результатов морским свинкам перед заражением ежедневно вводят большие дозы кортизона, снижающего их резистентность. Через 3—4 нед после введения исследуемого материала морской свинке ставят туберкулиновую пробу. Положительная реакция будет свидетельствовать о присутствии микобактерий туберкулеза. Если животное не погибает через 3 мес, его забивают и различные ткани подвергают микроскопическому исследованию. Для целей диагностики этот метод в настоящее время имеет ограниченное применение, поскольку посев на питательные среды дает достаточно хорошие результаты.