Вы здесь

Лабораторная диагностика при туберкулезе

Возбудитель туберкулеза (общие сведения)

Определение. Возбудитель туберкулеза, открытый Робертом Кохом в 1882 г., относится к обширной группе микобактерий, родственных нашим растительным организмам — лучистым грибам или актиномнцетам.

Учитывая, что возбудитель туберкулеза является микробом не спороносным, имеет палочковидную форму и принадлежит к низшим грибам, съезд фтизиатров рекомендовал придерживаться термина «микобактерии туберкулеза» (mycos — гриб, bacterium — палочка), или «туберкулезные палочки». Допускается сокращенное название «БК» (бактерии Коха), что особенно удобно для записей в истории болезни, бланках лабораторных исследований или карточках диспансерного и статистического учета.



Кислотоустойчивость. Большинство микобактерий, в том числе и микобактерии туберкулеза, обладают характерной особенностью — кислотоустойчивостью (кислотоупорностью). Кислотоустойчивость слагается из двух свойств: трудного восприятия краски и ее сохранения при действии кислот, щелочей и спирта. Это качество микобактерий обусловливает и метод бактериоскопического и бактериологического исследования.

Морфология. Микобактерии туберкулеза имеют обычно форму тонкой палочки, иногда прямой, но чаще слегка изогнутой, со слегка округлыми концами; длина палочки колеблется от 0,8 до 1,5 μ, ширина от 0,2 до 0,5 μ, однако морфология палочек может варьировать в довольно широких пределах. Прежнее представление о том, что тело микроба покрыто толстой жиро-восковой оболочкой, которая якобы обусловливает кислотоустойчивость, было опровергнуто исследованиями с помощью электронного микроскопа: микобактерии туберкулеза имеют обычную клеточную оболочку, хотя и сложной структуры, толщина ее около 0,05 μ.

Биологические свойства. Размножаются микобактерии туберкулеза как обычным методом поперечного деления, так и путем сложного цикла развития.

Вирулентность микобактерий туберкулеза может колебаться в широких пределах — от высокой степени до полной потери ее (обычно временной). Для определения степени вирулентности заражают морских свинок разными дозами микобактерий (например, 0,1 и 0,0001 мг) и по длительности выживания животного и степени поражения его органов судят о степени вирулентности бактерий. Обычно придерживаются следующих градаций вирулентности: при заражении малыми дозами высокая вирулентность — гибель животного за 2—3 мес, средняя вирулентность — гибель животного за 4—-6 мес, слабая вирулентность — гибель через 6 мес.

Типы микобактерий туберкулеза. Существуют три типа микобактерий туберкулеза теплокровных: тип Человеческий (typus humanus или mycobacterium tuberculosis), тип бычий (typus bovinus) и тип птичий (typus avium или gallinaceus — куриный); первые два типа объединяют в тип микобактерий туберкулеза млекопитающих.

Выделение некоторыми авторами четвертого типа — мышиного (typus murinus или оксфордский штамм OVS) — не обосновано; мышиный штамм следует рассматривать как отклонение от бычьего типа.

Для человека эпидемиологическое значение имеют два типа микобактерий туберкулеза — человеческий и бычий. Случаи заболевания человека туберкулезом птичьего типа очень редки. Сельскохозяйственные и домашние животные восприимчивы обычно к палочкам бычьего типа, но могут поражаться и микобактериями человеческого и птичьего типов, особенно свиньи. Типы микобактерий туберкулеза довольно стабильны и взаимные переходы их наблюдаются редко.

В лабораторной практике нередко приходится определять тип микобактерий туберкулеза в патологическом материале. Существующие методы определения типов по морфологическим и культураль-ным признакам недостаточно надежны и могут применяться как ориентировочные; более определенно высказаться о типе БК можно на основании опытов на животных; дифференцирующим животным при определении человеческого и бычьего типа является кролик: при заражении микобактериями туберкулеза человеческого типа морская свинка быстро погибает, в то время как кролик выживает, при вскрытии после забоя у кролика находят только небольшое количество очагов; при заражении же микобактериями бычьего типа и морская свинка, и кролик поражаются в одинаковой степени. Для определения микобактерий птичьего типа заражают морскую свинку и курицу (или голубя): у свинки возникают только местные изменения, в то время как птица погибает от туберкулеза. Дифференци-ровку человеческого и бычьего типов микобактерий туберкулеза можно проводить и биохимическим методом, применяя ниациновую пробу.

Атипичные микобактерии. В последние годы внимание фтизиатров привлекает обнаружение в патологическом материале от человека так называемых атипичных микобактерий, или кислотоустойчивых нетуберкулезных микобактерий. Выделяются они как при туберкулезных, так и нетуберкулезпых поражениях. По своей морфологии (палочковидная форма) они не отличаются от микобактерий туберкулеза. Однако культуральные и вирулентные свойства их значительно отличны от свойств микобактерий туберкулеза: на питательных средах они дают рост культуры желтого, оранжевого или кирпичного цвета (хромогенные штаммы) или растут в виде масляного налета. Для лабораторных животных они слабо патогенны и вызывают своеобразные специфические изменения. Частота обнаружения атипичных микобактерий в разных странах и районах колеблется в широких пределах (от 0,25 до 10—15%); встречаются они также у сельскохозяйственных животных и в окружающей их среде. Природа атипичных микобактерий окончательно еще не выяснена. Во многих случаях удается доказать генетическое родство их с типичными микобактериями туберкулеза. Но в ряде случаев они отличаются от истинных БК и, возможно, возникают в результате проявления патогенных свойств у отдельных видов кислотоустойчивых сапрофитов. Большинство зарубежных авторов считают атипичные микобактерии самостоятельными видами микробов.

Заболевания, вызываемые атипичными микобактериями, получили название микобактериозов. Вследствие естественной устойчивости атипичных микобактерий к большинству туберкулостатиков лечение микобактериозов вызывает определенные затруднения. Описано уже много видов атипичных микобактерий. Чтобы как-то систематизировать их, Ranyon предложил распределить их в следующие четыре группы.

Первая группа — микобактерии фотохромогеиные, т. е. пигментирующиеся на свету; представителями их являются m. Kansasii, т. Balnei и др.

Вторая группа — скотохромогенные — пигментирующиеся в темноте (например, в термостате; сюда относятся, например, «оранжевые культуры» Булера и Поллака, mycobacterium Scrofulaceum и др.).

Третья группа — пефотохромогепные, т. е. пигмента не образующие; в эту группу включены Mycobacterium Battey, различные представители микобактерий типа Nocardia, а также микобактерии группы Avium (схожие с микобактериями туберкулеза птичьего типа, по таковыми не являющиеся).

Четвертая группа — быстрорастущие; к ним относятся микобактерии fortuitum, glasgovii и некоторые виды сапрофитов (смегмы, тимофеевой травы).

Бактериоскопические методы исследования на туберкулез

В обнаружении микобактерий туберкулеза применяют исследования житного материала: мокроты, слизи и гортани, про-мынны.у под желудка, промывных вод бронхов. Для исследования применяют бактериоскопию мазков, метод люминесцентной микроскопии.

Общие свойства мокроты и ее микроскопическое исследование

Доставленная в лабораторию мокрота (собранная в чистую сухую посуду утром натощак) подвергается вначале макроскопическому изучению. Определяют ее количество, запах, цвет, консистенцию и характер.

Определить характер мокроты должен микроскопист, сопоставляя микроскопическую картину мокроты с ее внешним видом.

При описании мокроты принято отмечать в протоколе в первую очередь те элементы, которые в ней преобладают:

  • 1) если мокрота жидкая и состоит из гнойных клеток, она имеет «гнойный характер»;
  • 2) если в мокроте преобладает гной, по к нему примешано лишь немного слизи, характер ее считается «гнойно-слизистым»;
  • 3) если количество слизи и гноя приблизительно одинаково, мокрота носит характер «слизисто-гнойной»;
  • 4) наконец, если гноя не видно даже под микроскопом, характер мокроты отмечают как «слизистый»;
  • 5) если мокрота состоит только из крови, — «кровянистый»;
  • 6) если преобладает кровь, но есть слизь и гной, — «кровянисто-слизисто-гнойный».

Консистенция мокроты может быть жидкой, полужидкой, вязкой и густой. При осмотре мокроты невооруженным глазом можно обнаружить следующее:

  • 1)    фибринозные слепки, форма и величина которых зависят от формы и величины бронхов, в просвете которых они образуются, эти образования имеют красноватый пли беловатый цвет, плотны, трудно разделяются; опущенные в сосуд с водой, они после встряхивания в воде обнаруживают древовидное строение; фибринозные слепки состоят из слизи и фибрина;
  • 2)    кусочки ткани новообразования могут быть выявлены в мокроте иногда раньше, чем опухоль будет диагностирована клинически и рентгенологически;
  • 3)    чечевицы или линзы — желтовато-беловатые образования величиной с булавочную головку; чечевицы представляют собой кусочки омертвевшей легочной ткани и состоят из детрита, эластических волокон и микобактерий туберкулеза;
  • 4)    пробки Дитриха и сходные с ними пробки из миндалин — беловатые и желтоватые зернышки мягкой консистенции; пробки Дитриха встречаются в мокроте при гнилостном бронхите, бронхо-эктазах, гангрене легкого. Под микроскопом в них обнаруживаются различные бактерии, кристаллы жирных кислот, капли жира и различные грибы;
  • 5)    друзы актиномикоза — мелкие плотноватые зернышки, напоминающие зерна манной крупы, плохо раздавливающиеся и располагающиеся в гнойных участках мокроты; в нативном препарате они представляют собой округлые образования желтого цвета; при большом увеличении центральная часть этих образований состоит из густого сплетения тонких ветвистых нитей мицелия; по периферии мицелий окружен колбовидными вздутиями; при окраске по Граму нити мицелия окрашиваются грамположительно, а колбы — в розовый цвет;
  • 6)    пузыри эхинококка — серовато-белые или желтого цвета.

Микроскопическое исследование мокроты заключается в изучении под микроскопом ее нативного препарата. С этой целью содержимое баночки или плевательницы переливают в чашку Петри, которую помещают на темном фоне. При отсутствии чашек Петри можно пользоваться стеклянными блюдцами или любой плоской стеклянной посудой (не фарфоровой). Пользуясь небольшими хорошо заостренными деревянными палочками длиной 20—22 см (отдельными для каждой мокроты), отбирают на предметное стекло небольшие гнойные комочки мокроты из 5—6 различных ее участков, покрывают их покровным стеклом и приготовляют таким образом нативный препарат, который рассматривают вначале при малом, а затем при большом увеличении микроскопа. Исследование нативного препарата дает возможность обнаружить не только клеточные элементы (лейкоциты, эритроциты, клетки плоского или мерцательного эпителия, альвеолярные и пылевые клетки), но и эластические волокна, кристаллы холестерина, крючья и мембраны эхинококка, друзы актиномикоза, растительных и животных паразитов, как, например, личинки стронгилоидоза, мигрирующих аскарид.

Альвеолярные клетки (альвеолярные макрофаги) обычно встречаются в слизистой мокроте, в начальных фазах воспаления. Часто они содержат различные пылевые включения (коричнево-черного цвета). При пороках сердца, застое крови в малом круге эти клетки содержат пигмент гемосидерин (дериват кровяного пигмента — так называемые клетки сердечных пороков). В отличие от пылевых клеток они содержат железо и дают положительную реакцию с берлинской лазурью. Реакцию на берлинскую лазурь ставят следующим образом: на предметное стекло кладут частицу свежей мокроты, приливают туда 1—2 капли 1—2% раствора соляной кислоты и через несколько секунд прибавляют столько же капель 2—5% раствора желтой кровяной соли; смешивают и покрывают покровным стеклом. Через 5—10 мин зернышки окрашиваются в синий цвет.

При исследовании свежих препаратов мокроты особое внимание следует обратить на наличие эластических волокон, присутствие которых указывает на разрушение легочной ткани. Эластические волокна встречаются в мокроте при туберкулезе, гангрене легкого н воспалительных процессах.

Эластические волокна встречаются трех типов.

1. Неизмененные, среди которых различают волокна с сохранением альвеолярного строения, с частичным сохранением его и без сохранения. Неизмененные эластические волокна выделяются в виде небольших или более крупных пучков и представляют собой блестящие двухкоитуриые нити со слегка заостренными концами, ветвистые, иногда густо переплетенные, местами повторяющие форму альвеол. Этот тип волокон встречается обычно у больных при свежем распаде легочной ткани, обусловленном чаще всего туберкуле юм, по иногда и другими легочными заболеваниями.

2 Коралловидные, или волокна Коплена—Джонса. Последние При малом увеличении микроскопа представляют собой грубые образования, чаще темного цвета.

Обызиествленные волокна имеют вид небольших пучков, состоящих из грубоватых волокон, пропитанных солями извести. В связи с последним обстоятельством они становятся ломкими и распадаются на отдельные фрагменты. Если в нативном препарате, кроме обызвествленных волокон, находят соли извести, кристаллы холестерина, а в окрашенном препарате — туберкулезных микобак-терий часто в виде осколков, то наличие этих четырех элементов в мокроте, получивших в совокупности название триады Эрлиха, указывает на обострение в зоне старого петрифицированного туберкулезного очага.

При микроскопическом исследовании мокроты следует обращать внимание на присутствие грибковых микроорганизмов. Для этого исследуют нативные препараты мокроты, в которой могут встречаться дрожжевые клетки, их скопления и нити мицелия.

Наряду с исследованием нативпых препаратов в ряде случаев для клиники имеет значение и цитологическое исследование мокроты.

Бактериоскопическое исследование мокроты. Для определения бактерийной флоры мокроты пользуются окрашенными препаратами. Для этого на предметное стекло выбирают деревянными палочками гнойные комочки мокроты и растирают их между двумя стеклами, приготовляя таким образом мазки. Мазки не должны быть очень толстыми или очень тонкими. Затем высушенные на воздухе препараты фиксируют на пламени горелки (трехкратным проведением через пламя). Таких препаратов готовят 2—3. Один из них используют для окраски на микобактерии туберкулеза, другой — для окраски по Граму.

Одним из наиболее надежных способов окраски микобактерий туберкулеза является способ Циля—Нельсена. На фиксированный мазок наливают основной фуксин Циля и подогревают препарат до появления паров. После охлаждения мазка краску сливают и мазок обмывают водой, затем мазок обесцвечивают, наливая на стекло 10—15% серную кислоту или 3% солянокислый спирт до появления бледно-розового цвета, после чего мазок вновь смывают водой, затем препарат докрашивают 1% раствором метиленового синего, наливая раствор на полминуты. После этого препарат обмывают водой, просушивают на воздухе и подвергают бактериоскопии. На окрашенный и высушенный мазок кладут каплю кедрового масла. Микроскопировать начинают с левого верхнего угла, идя сверху вниз, затем вновь поднимаются вверх и т. д., проходя все поля зрения до конца препарата. Туберкулезные микобактерии чаще всего располагаются под углом друг к другу, среди лейкоцитов или внутри них в виде тонких прямых, иногда слегка изогнутых, изящных красных палочек с зернистостью или без нее. Окрашены они обычно равномерно па всем протяжении в ярко-красный цвет.

Ввиду того что широкое применение антибиотиков и химиопре-паратов меняет морфологию микобактерий туберкулеза, в ряде случаев при исследовании препаратов могут обнаруживаться и ветвистые формы неравномерной величины и бледно окрашенные. Применение антибиотиков и химиопрепаратов нередко способствует прекращению выделения микобактерий, исчезновение микобактерий туберкулеза в мокроте наблюдается в 50—95% случаев через 3—6 мес после лечения.

При бактериоскопическом исследовании на туберкулез следует обращать внимание на возможное присутствие в препарате кислотоустойчивых сапрофитов, которые могут дать повод для ошибочного смешения их с туберкулезными микобактериями. Кислотоустойчивые сапрофиты, попадая с пищей в организм человека, могут быть выделены из мокроты, желудочного содержимого. Особенно часто они отмечаются в мокроте у больных, страдающих различными нетуберкулезными заболеваниями легких — хроническим рецидивирующим бронхитом, новообразованиями легкого, интерсти-циальной пневмонией, абсцессами легкого; кроме того, кислотоустойчивые сапрофиты могут в отдельных случаях обитать в ушной сере, носовой слизи.

Кислотоустойчивые сапрофиты отличаются от туберкулезных микобактерий по следующим признакам:

  • 1)    морфология: кислотоустойчивые сапрофиты обычно более толстые, грубые, редко зернистые в отличие от тонких, изящных, часто зернистых туберкулезных микобактерий; кроме того, они отличаются большим полиморфизмом; в одном и том же препарате встречаются длинные и короткие, толстые и тонкие палочки, иногда со. вздутиями на концах, заостренные или веретенообразные;
  • 2)    окраска: кислотоустойчивые сапрофиты часто бывают неравномерно окрашены; наряду с ярко окрашенными встречаются очень бледные экземпляры, а иногда наблюдаются палочки, окрашенные на двух полюсах по-разному; оттенок краски кислотоустойчивых сапрофитов иной, чем у туберкулезных микобактерий, — буроватый или, наоборот, розоватый, розоватый в отличие от ярко-крас-иых туберкулезных;
  • 3)    расположение в препарате: кислотоустойчивые сапрофиты обычно располагаются в слизи и среди клеток плоского или мерцательного эпителия, иногда на красноватой подкладке, в то время как туберкулезные микобактерии чаще всего располагаются среди лейкоцитов; характерно также их ветвистое расположение.

Обнаружение в мокроте микобактерий с указанными выше типкториальными и морфологическими особенностями заставляет проверить их спиртоустойчивость путем повторного обесцвечивания окрашенного по Цплю—Нельсепу мазка чистым спиртом в течение 20 мин и дополнительной окраской 0,5%о раствором метилено-ного синего. Туберкулезные микобактерии, обладающие, кроме кислотоустойчивости, и спиртоустойчивостью, после дополнительного обесцвечивания спиртом остаются красными. Если микобактерии после обесцвечивания спиртом теряют свой первоначальный цвет и превращаются и синие палочки, это свидетельствует о том, что они кислотоустойчивы, по епиртоподатливы, т. с. нетуберкулезные.

При повторном использовании этих стекол без достаточной механической очистки застрявшие в трещинах микобактерии могут быть ошибочно приписаны другому больному. Кипячение стекол не предотвращает указанной возможности ошибок, так как убитые кипячением микобактерии не теряют способности окрашиваться. Ввиду этого при исследовании материала на туберкулез необходимо пользоваться только предметными стеклами, ие имеющими каких-либо трещин и царапин.

В случаях отрицательного результата бактериоскопического исследования мазка следует применять способы обогащения мокроты, в частности способа Кагана, Петрова, Бидерта. В основу их положен принцип гомогенизации мокроты и концентрации микобактерий туберкулеза в небольшом объеме. Несмотря на имеющиеся в литературе указания, что применение методов накопления повышает процент положительных находок, на практике они применяются довольно редко. Получающийся неудовлетворительный результат зависит, по-видимому, от частичного растворения микобактерий туберкулеза в антиформииё, уменьшения туберкулезных микобактерий к окрашиванию и неполного оседания при нередко применяемом центрифугировании.

Метод флотации — наиболее эффективный метод обогащения. Он основан на том, что при встряхивании двух жидкостей с различным удельным весом вещество с более легким удельным весом вследствие физического закона поднимается кверху и увлекает за собой туберкулезные микобактерии, находящиеся во взвешенном состоянии в жидкости.

Таким образом, туберкулезные микобактерии «всплывают» на поверхность. Методом флотации может быть обработан любой патологический материал.

Для исследования методом флотации мокроту собирают в течение 1—3 дней (при условии, если больной выделяет ее очень мало). Собранную мокроту в количестве от 1 до 10—15 мл (не больше) переливают в бутылку или колбу емкостью 250 мл, куда добавляют на глаз 0,5% едкий натр или едкое кали в количестве, равном количеству мокроты, и в течение 5—10 мин тщательно встряхивают для растворения комочков гноя; ставить колбу на водяную баню после добавления щелочи не обязательно, так как мокрота хорошо гомогенизируется и без подогревания. После этого к гомогенизированному материалу добавляют приблизительно 100 мл дистиллированной воды и 0,5 мл ксилола или бензина. Все содержимое бутылки тщательно встряхивают в течение 5—10 мин, затем вновь доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки. Последнюю с содержимым оставляют стоять при комнатной температуре на 30—20 мин. После стояния на поверхности жидкости образуется сливковообразное кольцо. Стерильной пипеткой отсасывают часть образовавшегося у горлышка бутылки белого кольца и наносят на два предметных стекла, заранее разложенных на большом стекле, покрывающем нагретую до 70—80° водяную баню. На мазок наносят еще раз несколько капель из кольца. Такое наслаивание производят 5—6 раз, причем каждую каплю высушивают до нанесения следующей. Высушивание мазков на бане обеспечивает фиксацию материала. Затем мазки обезжиривают эфиром и подвергают окраске; основной фуксин Циля наливают на предметные стекла, находящиеся на водяной бане, на 10 мин, затем стекла с мазками промывают водопроводной водой и заливают каждое в отдельности 3% солянокислым спиртом до полного обесцвечивания. Затем мазки вновь промывают водопроводной водой и докрашивают 0,25 % о водным раствором пикриновой кислоты или 0,5°/оо раствором ме-тиленового синего. Вновь промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Клиника и лечение туберкулеза у детей

В ряде лабораторий для обнаружения микобактерий туберкулеза применяют метод седиментации (осаждения) мокроты вместо флотации. С этой целью при обработке мокроты используют не толуол или бензин, а хлороформ (в том же количестве), который вследствие своей тяжести, падая на дно, увлекает за собой микобактерии туберкулеза. При обработке мокроты методом седиментации препараты имеют более загрязненный вид, особенно при исследовании промывных вод желудка. Поэтому предпочтительнее пользоваться методом флотации.

При использовании метода флотации следует соблюдать ряд технических деталей во избежание ошибок. Одним из источников лабораторных ошибок может явиться недостаточная механическая очистка посуды, зондов, резиновых пробок, пипеток и пр. Поэтому используемая посуда должна подвергаться очень тщательной обработке.

Метод люминесцентной микроскопии. Люминесцентная микроскопия основана на различии свечения микроско-иируемого объекта в ультрафиолетовом или коротковолновом спектре видимого света. Люминесцентный метод дает возможность обнаружить микобактерий туберкулеза в значительно большем проценте случаев, чем метод прямой бактериоскопии мазков, окрашенных по Цилю—Нельсену (на 9—10%, по другим авторам — на 10-18%).

Для люминесцентной микроскопии применяют различные методы окраски. Мы пользуемся в последнее время методом Адам-чнка: препараты мазков с исследуемой мокротой фиксируют в метиловом спирте 5—7 мин и окрашивают раствором акридинового-оранжевого в течение 4—24 ч. Окраска холодная. При окраске нельзя допускать высыхания препаратов. Их лучше погружать в ванночку.

Исследование промывных вод желудка. Особенно широкое распространение этот способ получил в клинике туберкулеза у детей, где он используется не только для подтверждения бацилловыделения (так как известно, что большая часть детей, страдающих легочным туберкулезом, заглатывают мокроту), по и с целью ранней диагностики туберкулеза.

Исследование промывных вод желудка методом флотации производят следующим образом: больному утром натощак дают выпить 200 мл дистиллированной воды, после чего сразу с помощью толстого зонда жидкость извлекают из желудка в стерильный стакан. Перед обработкой полученный материал переливают в колбу емкостью 250—300 мл и приливают к нему 2—3 мл 0,5% раствора едкого натра. Смесь встряхивают в течение 5 мин, добавляют к ней 1—2 мл ксилола или бензина и вновь встряхивают 5—10 мин (дистиллированную воду при обработке промывных вод желудка добавлять не нужно). Затем колбу с содержимым оставляют стоять в течение 30 мин при комнатной температуре. Образовавшееся у горлышка колбы сливкообразное кольцо обрабатывают в дальнейшем по той же методике, что и мокроту.

При исследовании промывных вод желудка методом флотации положительный ответ дают в том случае, если в препарате отмечается не менее 5—7 типичных туберкулезных микобактерий. При меньшем их количестве исследование необходимо повторить. В клинике имеет значение только повторное обнаружение туберкулезных микобактерий в промывных водах желудка.

Исследование промывных вод бронхов. Больному утром натощак орошают через пульверизатор 2 мл 1 % раствора дикаина язык, слизистую оболочку небных дужек, глотки и грушевидных ямок. Через 2—3 мин в гортань вливают гортанным шприцем 1—2 мл 2% раствора дикаина. Еще через 2—3 мин, после наступления анастезии, кладут больного на бок, соответствующий исследуемому легкому, и медленно вливают гортанным шприцем на середину основания языка 10—20 мл физиологического раствора, подогретого до 37°. Раствор стекает с основания языка по боковой стенке глотки в гортань и поступает в главный бронх исследуемого легкого. Во время вливания солевого раствора необходимо держать высунутый язык больного марлевой салфеткой, чтобы препятствовать проглатыванию раствора. Во избежание боли от нажима на уздечку языка последнюю смазывают раствором дикаина. О попадании раствора в бронхи легкого узнают по появлению измененного дыхания и хрипов, вызываемых влитым раствором. Положение больного на боку способствует попаданию раствора в нужный бронх. Вливание раствора хлористого натрия комнатной температуры вызывает раздражение слизистой бронхов, вследствие чего наступают усиленное отделение слизи и кашель. Больной откашливает раствор вместе со слизыо из глубоких дыхательных путей в стерильный стаканчик.

Противопоказанием для промывания бронхов являются недавно перенесенное заболевание сердца и сосудов, сердечная декомпенсация и бронхиальная астма.

Метод исследования промывных вод бронхов представляет ценность для обнаружения микобактерий туберкулеза у больных, не выделяющих мокроту.

Бактериологические исследования на туберкулез

Общие данные. Бактериологический метод исследования патологического материала на микобактерии туберкулеза является более чувствительным, чем бактериоскопический. Однако надо иметь в виду, что в некоторых случаях под влиянием химиотерапии микобактерии туберкулеза могут не дать роста на питательных средах, в то время как при бактериоскопии они выявляются.

При бактериоскопии мазков, окрашенных по Цилю—Нельсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены в тех случаях, если в 1 мл материала их содержится около 100 000—500 000; посев может дать положительный результат, если количество микобактерий составляет несколько десятков в 1 мл материала.

Для посева может быть использован любой материал, получаемый от больного (мокрота, моча, экссудаты, ликвор, промывные воды желудка и бронхов, мазки из гортани и т. д.), а также операционный и секционный материал.

Чаще всего приходится Иметь дело с мокротой. При отсутствии у больного мокроты обычно исследуют промывные воды бронхов и желудка, в последнее время рекомендуется провоцировать отделение мокроты с помощью ингаляций. Используется портативный переносной аэрозольный ингалятор типа АИ-1. В качестве ингалируемой смеси рекомендуется 15% раствор поваренной соли в 1 % питьевой соде. Для появления мокроты необходимо ингали-ровать от 30 до 60 мл смеси, подогретой до 42—45°. Используются индивидуальные мерные стаканчики и фарфоровые мундштуки, которые стерилизуют кипячением в 1 % растворе соды в течение 40 мин.

Обработка и посев мокроты. Мокроту собирают в стерильную плевательницу. Предварительно за 2 сут отменяют бактериальное лечение. При отсутствии мокроты или недостаточном ее количестве можно назначить па 1—2 дня отхаркивающие средства. Перед тем как собрать мокроту, больной должен прополоскать рот и зев кипяченой водой. Для исследования лучше брать первую утреннюю порцию мокроты. Для освобождения мокроты от вторичной флоры при посеве обрабатывают материал серной кислотой по методу Го-ил или Мизури. Микобактерии туберкулеза захватываются образующейся иеной, которую и засевают платиновой петлей. Для обработки мокроты пользуются комбинацией обоих методов, предложенной Гель-бергом (после посева пены материал центрифугируют и осадок тоже засевают).

Для освобождения мокроты от вторичной флоры более охотно пользуются 10% раствором трехзамещенного фосфата натрия (Na34), который хорошо гомогенизирует мокроту и освобождает ее от вторичной флоры. Хорошо гомогенизированную мокроту заливают двойным количеством этого раствора, тщательно смешивают и оставляют на сутки при температуре 37° в термостате. На следующий день весь материал центрифугируют, осадок разводят в 1,5— 2 мл физиологического раствора или среды Школьниковой и засевают пипеткой на яичную среду.

Посев ликвора, мочи, Зкссудата, промывных вод желудка и бронхов. Всякий жидкий материал, поступающий в лабораторию для посева, необходимо сначала центрифугировать. Если материал не содержит вторичной флоры (серозный экссудат), то осадок или нижний слой жидкости при отсутствии осадка засевают без обработки на яичную среду. При посеве гнойного экссудата, мочи, промывных вод желудка или бронхов осадок после центрифугирования обрабатывают 3% серной кислотой в течение 20 мин, включая повторное центрифугирование, и после удаления надосадочной жидкости засевают на яичную среду; ликвор, полученный стерильно, засевают без центрифугирования и без обработки кислотой.

Промывные воды желудка необходимо засевать как можно быстрее после их получения, так как жизнеспособность микобактерий туберкулеза в промывных водах под влиянием желудочного сока со временем снижается. Для исследования в лабораторию доставляют все полученное количество промывной жидкости.

Посев мазка из гортани. Микобактерии туберкулеза можно обнаружить в слизи из гортани. Больному предлагают покашлять и под контролем гортанного зеркала ватным тампоном снимают слизь с надгортанника. Тампон, снятый с зонда, помещают в ступку с 3—5% серной кислотой, тщательно отжимают, тампон удаляют, жидкость центрифугируют и осадок засевают на яичную среду. Обрабатывать тампон можно и другим способом: его осторожно опускают в пробирку с серной кислотой на 20 мин, так же осторожно переносят в пробирку с физиологическим раствором на несколько минут, а затем делают посев, втирая тампон в поверхность питательной среды.

Таким же образом засевают всякий материал, взятый на тампоне (гноя, мазков из ран и т. д.).

Посев крови. Из вены берут около 5 мл крови в пробирку со стерильным раствором цитрата натрия. После центрифугирования осадок гемолизируют стерильной дистиллированной водой, центрифугируют, обрабатывают 3% серной кислотой и после повторного центрифугирования засевают на питательную среду.

Ускоренные методы посевов. Микобактерии туберкулеза на- питательных средах растут значительно медленнее, чем другие патогенные микробы. Предложены ускоренные методы посевов. Однако, несмотря на более короткие сроки роста, процент положительных результатов при этих методах значительно меньше. Поэтому, применяя ускоренные методы, рекомендуется высевать материал одновременно на плотные яичные среды, и если при ускоренном методе рост культуры отсутствует, надо ждать результатов посева на яичных средах.

Кроме того, следует учитывать, что ускоренные методы посевов опасны в смысле рассеивания инфекции, поэтому применять их надо осторожно.

Метод Прайса. Из гнойных комочков мокроты делают мазки на стерильных предметных стеклах, подсушивают их, обрабатывают 3% серной кислотой путем погружения в кислоту на 5 мин, затем дважды промывают в стерильной дистиллированной воде и погружают в пробирки с кровяной средой (1 часть крови+7 частей воды). Через 7—10 дней стекла извлекают из пробирок, отмывают от ь'рови, сушат, фиксируют и после окраски по Цилю—Нельсену микроскопируют. При этом в случае роста видны типичные микроколонии палочек в виде кос и жгутов.

Метод глубинного посева на кровяную среду. Материал обрабатывают обычным способом. Перед посевом осадок дважды отмывают при центрифугировании стерильной дистиллированной водой. Через 10—20 дней делают мазки из етцентрифугиро-ванного и отмытого осадка. Количество положительных результатов повышается при высевах с кровяной среды на яичную.

Микобактерии туберкулеза растут медленно, поэтому пробирки с плотной средой нужно выдерживать в термостате при температуре 37—38° до 3 мес (если рост не появляется раньше), и только после этого срока может быть дан отрицательный ответ. При появлении роста делают мазки из выросшей культуры, окрашивают по Цилю — Иельсену и микроскопируют. Если культура вырастает в обычные сроки и имеет типичные культуральные и морфологические признаки, то дают положительный ответ. При появлении роста в более ранние сроки и обнаружении каких-либо особенностей в культуральных и морфологических свойствах (пигментированная культура, нетипичный рост) культура подлежит дальнейшему изучению.

Биологический метод диагностики туберкулеза. При отрицательных результатах бактериоскопии и посева материала, исследуемого на микобактерии туберкулеза, если все же подозревается туберкулез, применяют опыты на животных (биологическая проба).

Определение лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза является важнейшим видом лабораторных исследований при туберкулезе, так как клиническое и эпидемиологическое значение лекарственной устойчивости непрерывно возрастает, а сама устойчивость значительно затрудняет лечение больных.

Для определения лекарственной устойчивости микобактерий их высевают на питательные среды, содержащие различные концентрации препаратов, устойчивость к которым надо определить, и на среды, не содержащие препаратов (контроль). По истечении определенного срока сравнивают рост в контроле с ростом на средах, содержащих препараты. Применяют прямое и непрямое исследование устойчивости: при прямом — мокроту высевают непосредственно на среды с препаратами; при непрямом — культуру микобактерий сначала выделяют из материала, а затем определяют ее лекарственную чувствительность. Прямое определение дает ответ, естественно, в более короткие сроки. Однако пользоваться им можно только при наличии бактериоскопически положительной мокроты, т. е. такой, в которой при бактериоскопии мазков микобактерии туберкулеза обнаруживаются по нескольку в поле зрения. Бактериоскопически отрицательные мокроты требуют непрямого определения.

Первое исследование посева у вновь выявленного больного необходимо произвести до начала лечения в течение 3 дней подряд; две из выросших культур изучают. Известно, что результаты определения устойчивости микроба лечащий врач получает обычно через 2,5—3 мес. За это время, не ожидая результатов лабораторного исследования, он проводит курс лечения тремя препаратами первого ряда. К концу указанного срока врач выявляет первые клинические результаты лечения и получает лабораторные данные о лекарственной чувствительности микобактерий, что позволяет ему регулировать дальнейшее лечение препаратами первого и второго ряда в той или иной их комбинации.

Второе определение лекарственной чувствительности можно производить через 2,5—3 мес после первого, а в дальнейшем — в зависимости от хода лечения. Так как в ходе дальнейшего применения химиопрепаратов врач заинтересован в более скором получении результатов определения чувствительности, то второе и последующие определения можно производить также и прямым способом при наличии в мокроте бактериоскопически достаточного количества микобактерий (1—5 и более в частых полях зрения).

Единого метода определения устойчивости, который был бы принят во всех лабораториях, не имеется. Из методов, рекомендованных Комиссией экспертов ВОЗ, наибольшее применение нашли два: метод абсолютных концентраций и метод пропорций (Каннети, Риста и Гроссе).

При методе абсолютных концентраций определяют ту концентрацию препарата, при которой возможен рост микобактерий туберкулеза, и это характеризует устойчивость исследуемого штамма. При методе пропорций путем подсчета количества колоний микобактерий, выросших при засеве суспензии в концентрации Ю-5 в Пробирках с препаратом и контрольных, определяют процент бактериальных клеток, устойчивых к критической концентрации, по отношению к общему количеству жизнеспособных особей микобактерий в культуре.

Таким образом, метод абсолютных концентраций дает представление об устойчивости штамма микобактерий туберкулеза в целом, в то время как метод пропорций раскрывает соотношение между чувствительными и устойчивыми микобактериями данного штамма. По своим результатам оба метода равноценны. Однако метод абсолютных концентраций менее сложен и громоздок и поэтому рекомендуется для практики лабораторий противотуберкулезных учреждений. Метод пропорций можно применять для специальных исследований в клинике.

В целях унификации методов и сравнимости результатов исследования (что особенно важно при эпидемиологических клинических исследованиях) необходимо повсеместно определить устойчивость на плотной яичной среде — среде Левенштейна, рекомендованной ВОЗ и принятой в качестве международной стандартной среды.

У больных при продолжающемся выделении микобактерий туберкулеза для более быстрого определения лекарственной устойчивости можно применять ускоренные стекольные методы на кровяной среде. Однако применять их нужно с большой осторожностью, учитывая опасность рассеивания инфекции; кроме того, ускоренные с текольные методы часто дают расхождение в цифрах устойчивости, что приводит к необходимости повторного исследования культуральным методом.

Для приготовления 200 мл среды (для 40 определений лекарственной чувствительности) к 198 мл среды Левенштейна — Иенсена добавляют 2 мл рабочего раствора, начиная с малых концентраций в восходящем порядке, и разливают в пробирки. Среду с антибактериальными препаратами сохранять в холодильнике при 2—4° не более 1—2 мес. Хранение при комнатной температуре недопустимо.

Чтобы проверить правильность приготовления питательной среды и соответствие концентраций препаратов, каждую партию среды проверяют с использованием международного стандартного штамма микобактерий туберкулеза — H37Rv. При отсутствии в ла6ора!брйй итого штамма можно пользоваться свежевыделенным штаммом от Гшльиого, ранее не принимавшего бактериостатических препаратов. Контрольный штамм должен быть засеян точно так же, как и испытуемый. Среда приготовлена правильно, то контрольный штамм иг должен расти ни на одной из рабочих концентраций. Появление рис 1,1 на среде даже с самой маленькой концентрацией указывает им то, что были допущены ошибки при приготовлении среды или величина засева была слишком большой. В таком случае всю партию питательной среды удаляют, а опыт повторяют со свежей средой.

Цитология туберкулеза

Гемограмма при туберкулезе. Лейкоциты. Количество лейкоцитов колеблется от 5000 до 1200 в 1 мм3 крови. У больных с тяжелыми обострениями фиброзно-кавернозного туберкулеза, при которых известную роль играет вторичная флора, количество лейкоцитов может доходить до 12 000—15 000.

При оценке тяжести заболевания большое значение имеет определение ядерного сдвига нейтрофилов. Сдвиг ядра нейтрофи-лов влево при туберкулезе обычно бывает выражен одними палочко-ядерными.

У больных инфильтративными и очаговыми формами туберкулеза без распада отмечается сдвиг ядра нейтрофилов влево в пределах 7—10% палочкоядерных. При вспышках туберкулеза и явлениях деструкции легочной ткани сдвиг ядра нейтрофилов доходит до 10— 20% палочкоядерных. Значительное увеличение левого сдвига отмечается при обострении хронического фиброзно-кавернозного туберкулеза, а также при выраженных инфильтративно-пневмонических формах с явлениями распада. В этих случаях число палочкоядерных может достигать 20—30%, иногда 50% с небольшим количеством мета-миелоцитов (юные) и единичными промиелоцитами (0,5—0,25%).

При туберкулезе патологический процесс, помимо ядерного сдви-•га, вызывает изменения характера зернистости нейтрофилов: вместо обычной тонкой может появиться грубая патологическая зернистость.

В норме до 6% нейтрофилов содержат патологическую зернистость. На мазках, окрашенных для выявления патологической зернистости нейтрофилов, можно одновременно подсчитывать лейкоцитарную формулу, поэтому количество нейтрофилов с патологической зернистостью подсчитывают наряду с определением ядерного сдвига по отношению к числу встретившихся нейтрофилов (а не на 100 нейтрофилов). Патологическая зернистость нейтрофилов не возрастает параллельно ядерному сдвигу; обычно она наблюдается при затяж-пом течении туберкулезного обострения, при истощении нормального формирования нейтрофилов в костном мозге.

У больных с тяжелыми формами туберкулеза почти все нейтро-филы (80—90%) могут содержать патологическую зернистость, которая при затихании туберкулеза обычно держится дольше всех дру-1пх изменений гемограммы, свидетельствуя о неполном восстановлении функции костного мозга.

Лейкемоидные реакции при туберкулезе. Лейкемоидные реакции, связанные с туберкулезом, встречаются довольно редко, однако врач должен помнить о них, так как в отличие от лейкозов при них эффективно применение туберкулостатических препаратов. Можно выделить два типа реакций: гипопластический и гиперпластический (собственно лейкемоидный). При гиперпластическом типе количество лейкоцитов достигает 20 000—30 000. В крови появляется значительное количество (около 25%) примитивных ретикулярных клеток мо-ноцитондного характера. В базофильной протоплазме этих крупных

клеток встречаются единичные азурофильные зерна. Наряду с мони-цитоидными клетками выявляется резкий сдвиг влево нейтрофилов с появлением единичных миелоцитов. В отличие от лейкемий характерно отсутствие базофилов и эозинофилов, наблюдается выраженная лимфопения. Быстро развивается гипохромная анемия с уменьшением числа эритроцитов до 2 000 000—2 500 000.

Лейкемоидные реакции при туберкулезе носят большей частью преходящий характер, иногда наблюдается цикличность в их течении, которую можно связать с волнами гематогенной диссеминации.

При гипопластическом типе наблюдается стойкая выраженная лейкопения (до 1500—2500), анемия (1 500 000—2 700 000 эритроцитов) и тромбоцитопения (до 20 000). Выраженная нейтропения (20—30%) сопровождается резким сдвигом влево с наличием юных и миелоцитов. Эти формы дают небольшие ремиссии, но не полное восстановление лейкоцитарной формулы. При пункции грудины нередко удается обнаружить в костном мозге эпителиоидные бугорки, иногда с гигантскими клетками типа Лангханса, и массивные участки фиброзной ткани. Это указывает на туберкулез и помогает исключить лейкоз.

Окраска на патологическую зернистость нейтрофилов (по Момзену—Шмелеву). Для дифференцирования патологической зернистости мазки крови нужно окрашивать в растворе краски определенной степени кислотности (при pH 5,4). Для этого вместо дистиллированной воды для разведения краски берут буферные растворы. Фосфатно-буферную смесь готовят следующим образом: 11,876 г дифосфата натрия (Na2HPО4) разводят в 1 л дистиллированной воды; 9,078 г монофосфата калия (КН2РО4) разводят также в 1 л дистиллированной воды (соли отвешивают на химических весах); для получения нужного буферного раствора одну часть дифосфата натрия соединяют с 9 частями монофосфата калия.

Краску Романовского для данной окраски разводят следующим бразом? на 10 мл буферной смеси (приготовленной, как изложено выше, из 1 мл дифосфата натрия и 9 мл монофосфата калия) берут 2,5 мл 1%о водного раствора азура 2 и 1,5 мл 1%о водного раствора эозина. Способ окраски:

  • 1) фиксация мазка метиловым спиртом — 4 мин;
  • 2) окраска азурэозином, разведенным фосфатно-буфер-ной смесью, — 1 ч;
  • 3) быстрое отмывание водой;
  • 4) просушивание препаратов обязательно фильтровальной бумагой.

При правильной окраске мазка наряду с нейтрофилами, протоплазма которых содержит зерна, встречаются нейтрофилы с совершенно однородной розовой протоплазмой.

Проба Торна. В клинике туберкулеза нередко пользуются эози-нофильной пробой Торна — одной из проб для определения функционального состояния коры надпочечников. Она основана на способности АКТГ стимулировать секрецию кортикостероидных гормонов, под влиянием которых уменьшается количество циркулирующих в крови эозинофилов. При нормальной функции коры надпочечников в ответ на введение 20—25 единиц АКТГ содержание эозинофилов снижается на 50% и более. Максимум падения наблюдается приблизительно через 4 ч, поэтому при проведении пробы Торна количество эозинофилов подсчитывают до введения АКТГ больному и через 4 ч.

Кровь набирают в обычный смеситель для лейкоцитов всегда до метки и разводят до метки II специальной жидкостью (ее состав: 10 мл 1% водного раствора эозина, 10 мл ацетона, 80 мл дистиллированной воды). После смешения крови и жидкости смеситель встряхивают в течение 2—3 мин. Через 10—15 мин, но не позднее чем через 30 мин, наполняют камеру и подсчитывают число эозинофилов. Под микроскопом эозииофилы хорошо выделяются своими блестящими красноватыми зернами на слегка красноватом фоне сетки, другие лейкоциты едва видны. Все эритроциты растворяются. Эозинофилы сосчитывают на площади всей сетки, а затем их число переводят на 1 мм3.

Число эозинофилов определяют в камере Фукса—Розенталя; полученное при подсчете на всей площади сетки камеры число эозинофилов умножают на 10 (степень разведения крови) и делят на 3,2 (объем камеры).

Протоплазма бледно голубого цвета. В эпителиоидных бугорках не всегда видны границы отдельных клеток. Иногда эпителиоидные бугорки бывают пронизаны грубыми фиброзными волокнами. Гигантская клетка Пирогова—Лангханса содержит несколько крупных ядер, располагающихся по периферии протоплазмы. Отдельные ядра в гигантской клетке по структуре и величине не отличаются от ядер эпи-телиоидных клеток. Казеозный детрит имеет форму неправильных глыбок, красящихся по гематологической методике в темно-вишне-вый цвет. Нередко в нем содержатся единичные и сохранившие свою структуру лимфоциты, реже эпителиоидные и гигантские клетки Лангханса.

Казеозный детрит макроскопически представляет собой крош-коватую массу, с трудом набирающуюся в шприц. Он встречается не только при творожистой форме поражения лимфатических узлов. Среди гиперплазированной лимфаденоидпой ткани также могут быть небольшие участки казеоза, которые попадают в пунктат. Казеозный детрит может содержать соли аморфных фосфатов блестящего беловато-желтоватого цвета. В случаях гнойного расплавления железистой ткани в казеозном детрите обнаруживаются лишь единичные нейтрофилы, в то время как в нетуберкулезных нагноительных процессах наблюдается резко выраженная нейтрофильная и макрофагальная реакция.

В связи с повсеместным введением в практику внутрикожного метода вакцинации и ревакцинации против туберкулеза в последнее время имеют место осложнения со стороны регионарных лимфатических узлов в виде поствакцинальных лимфаденитов, холодных абсцессов и келоидных рубцов на месте прививки. Эти осложнения, по литературным данным, за период 1962—1964 гг. отмечались сравнительно редко — от 0,003 до 0,01%.

Поствакцинальные лимфадениты развиваются преимущественно у детей раннего возраста. Цитологическое исследование дало возможность отметить, что реакция возникающих осложнений протекает по типу специфического туберкулезного воспаления с преобладанием казеозного перерождения и ранней кальцинацией процесса. Реже имеет место нейтрофильная реакция с эпителиоидными и гигантскими клетками типа Пирогова—Лангханса.

В пунктатах (бецежитов) нередко можно обнаружить бактериоскопически кислото- и спиртоустойчивые палочки, которые при посеве дают рост культуры БЦЖ.

Заболеванием, от которого приходится дифференцировать туберкулезный лимфаденит, является лимфогранулематоз. В типичных случаях пораженные лимфогранулематозом узлы бывают плотной консистенции, подвижны, безболезненны и располагаются большими пакетами, в которых отчетливо прощупываются отдельные узлы. В начальной стадии процесса, когда лимфогранулематозные узлы не образовали еще характерных конгломератов, при пальпации их бывает трудно отличить от гиперпластической стадии туберкулезного лимфаденита. Характерным морфологическим признаком лимфогранулематоза является картина клеточного полиморфизма с преобладанием уродливых лимфоидно-ретикулярных клеток. Встречаются также единичные нейтрофилы, эозинофилы, плазмоциты, лимфоциты. Особенно подкрепляют диагноз гигантские клетки Березовского — Штернберга, имеющие неправильно конту-рированную протоплазму и содержащие несколько крупных и мелких ядер. Структура ядра имеет грубозернистое расположение хроматина. В ядрах видны крупные синевато-голубоватые ядрышки.



Из опухолевых поражений лимфатических узлов чаще всего приходится наблюдать метастазы рака, реже ретикулосаркому. Характерной особенностью лимфатических узлов, пораженных злокачественными новообразованиями, является их твердая консистенция, иногда угловатая форма и малая подвижность в клетчатке. При исследовании препаратов клетки лимфоидной ткани не обнаруживаются. Препарат состоит из малодифференцированных элементов, располагающихся большей частью в виде конгломератов. Для них характерны:

  • а) разнообразие форм и размеров клетки;
  • б) наличие гигантских клеток;
  • в) большое ядерно-протоплазменное соотношение;
  • г) наличие крупных нуклеол (последние не всегда могут наблюдаться в ядрах злокачественных клеток);
  • д) неравномерная окраска клеток;
  • е) резко выраженная базофилия протоплазмы.

Дермоидные кисты, невриномы, аденомы располагаются в виде одиночных образований в подчелюстной и надключичной областях шеи. Струмы же щитовидной железы локализуются преимущественно па внутреннем крае грудиио-ключично-сосцевидной мышцы. Невриномы, аденомы, липомы большей частью мягкой консистенции, эластичны и подвижны, нейрофибромы, смешанные опухоли слюнных желез отличаются твердой консистенцией, малоподвижны.

Макроскопически материал, получаемый при пункции, неодинаков. Пунктаты дермоидных кист чаще всего представляют собой грязноватого цвета жидкость, реже — кашицеобразную массу. При пункции струм получают липкий желтоватого цвета субстрат. Смешанные и простые железистые опухоли отличаются геморрагическим субстратом. При исследовании пунктата аденом характерным признаком является наличие небольших групп клеток одинаковой величины с круглым, иногда овальным ядром. Клетки располагаются на фоне эритроцитов в виде небольших скоплений. Хроматин ядра отличается грубосетчатым равномерным распределением, протоплазма голубоватого цвета, кое-где имеет вид общего синцития. В мазках так называемых смешанных опухолей железистые клетки располагаются среди тонких волокон соединительной ткани, окрашенных в розовый цвет. Пунктаты дермоидных кист состоят из клеток плоского эпителия в различных стадиях ороговения с наличием кристаллов холестерина, а иногда (вероятно, при начинающемся нагноении кисты) и нейтрофилов. Для струм характерны пласты крупных ретикуло-гистиоцитарных клеток, содержащих в своей протоплазме глыбкн темно-зеленого пигмента. Пролиферирующие струмы характеризуются конгломератами более мелких клеток с чертами злокачественного роста. Доброкачественные опухоли, развивающиеся из нервных волокон (невриномы), при цитологическом исследовании дают картину своеобразно переплетающихся веретенообразных клеток с узким ободком протоплазмы на концах. При нейрофибромах наряду с клеточными элементами имеется разрастание и соединительной ткани.

При актиномикозе цитологическое исследование обнаруживает в препаратах не только группы соединительнотканных клеток, расположенных среди нейтрофилов, но и длинные нити мицелия. В этих случаях для подтверждения диагноза актиномикоза необходимо исследовать нативный препарат, в котором можно обнаружить друзы актиномикоза.

Цитологическое исследование костного мозга на туберкулез. Для исследования костного мозга применяют специальную иглу Кассирского, снабженную предохранительным щитком. Перед проколом шприц кипятят, промывают спиртом и высушивают эфиром. После того как будет пройдена передняя стенка грудины и игла достигнет губчатого вещества, из нее извлекают мандрен. На иглу насаживают 10-граммовый шприц «Рекорд» и насасывают материал. При первом поступлении кровянистого субстрата в шприц подъем поршня прекращают. Шприц снимают с иглы и последнюю извлекают из грудины. Затем с помощью шприца из иглы выдувают костномозговой субстрат на предметные стекла. При приготовлении препаратов одним концом шлифованного стекла слегка придавливают материал и размазывают его. Окрашивают препараты по Райту — Романовскому.

Для исследования костного мозга на туберкулез рекомендуется просматривать 20—25 препаратов. Морфологическая структура специфических элементов туберкулезной гранулемы в препаратах костного мозга такая же, как в пунктатах лимфатических узлов, за исключением того, что эпителиоидные бугорки располагаются среди элементов миелоидного ряда. В препаратах костного мозга при исследовании наряду со свежими эпителиоидными бугорками нередко могут быть найдены бугорки в стадии обратного развития. В некоторых случаях обнаруживаются только крупные участки фиброзной ткани без эпителиоидных клеток. Наличие последних не дает возможности с уверенностью говорить о туберкулезной природе поражения костного мозга, однако они свидетельствуют о вовлечении костного мозга в патологический процесс.

Эпителиоидные бугорки образуются в костном мозге прежде всего при гематогенно-диссеминированных формах туберкулеза в фазу острой диссеминации и реже при других формах туберкулеза. В ранний период первичной туберкулезной инфекции в костном мозге могут быть обнаружены мелкие участки казеозного некроза, а также скопления ретикуло-гистиоцитарных клеток, формирующихся по тину эпителиоидных бугорков, и участки фиброзной ткани.

Цитологическое исследование плеврального экссудата и асци-гичсской жидкости. Экссудат, возникающий при воспалении плевры, может иметь различный клеточный состав. Выпот при туберкулезе может быть связан с проявлением аллергической реакции серозных оболочек, с высыпанием бугорков на плевре и отражать туберкулезное нагноение. Перерожденные мезотелиальные клетки встречаются при пгопластических процессах, мезотелиоме, раке плевры и при метастазах рака в плевру.

Жидкость из брюшной полости обрабатывают по той же методике, что и экссудаты.

Цитологическое исследование мокроты. В клинике туберкулеза н последнее время с целью дифференциальной диагностики заболеваний легких используют методику цитологического исследования мокроты, основанную на изучении макро-, микроскопического и Цитологического анализа.

При исследовании мазков, окрашенных по гематологической методике, ряд признаков, свойственных той или другой ткани, выявляется значительно ярче, чем при исследовании нативных препаратов. Это имеет существенное значение для цитологического заключения.

Для приготовления мазков мокроту выливают на чашки Петри, из которой деревянными палочками выбирают беловато-желтоватого цвета и гнойные комочки, прожилки крови и беловато-сероватые участки слизи. Отобранные частицы переносят деревянными палочками на предметные стекла и размазывают кругообразными движениями.

После высыхания на воздухе мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 10 мин и окрашивают по методу Романовского или лучше Райта—Романовского. Препараты высушивают на воздухе и исследуют под микроскопом (с малым увеличением и с иммерсионной системой). Рекомендуется приготавливать и просматривать не менее 10—12 препаратов.

Цитологическое исследование мокроты имеет существенное значение в диагностике бластоматозных процессов, атипически протекающих форм туберкулеза, некоторых диссемииированных процессов, симулирующих туберкулез (гемосидероз, рак), медиастиналь-но-легочной формы лимфогранулематоза.

Цитологически мокрота больных туберкулезом имеет некоторые особенности. Она отличается своеобразным розовато-фиолетовым фоном, обусловленным наличием казеозного детрита, располагающегося в виде аморфных масс, и нейтрофилами преимущественно в стадии полного расплавления. Нередко при распаде обызвествлен-ных очагов в мокроте могут обнаруживаться соли извести. Для препаратов мокроты больных туберкулезом характерны скопления мононуклеарных клеток с ядром круглой или бобовидной формы и протоплазмой голубоватого цвета. Среди них могут иметь место и переходные формы к эпителиоидным клеткам. П. А. Шмелев связывает появление мононуклеарных клеток (моноцитоидпого характера) с аллергическими аутоагрессивными реакциями, осложняющими основное заболевание. В препаратах мокроты нередко обнаруживают эозинофилы, которые располагаются значительными скоплениями. Увеличенное количество эозииофилов у одних больных можно связать с приемом химиопрепаратов, обусловливающих эозинофилию в периферической крови и соответственно в мокроте; у других это явление можно объяснить самим туберкулезным заболеванием.

Наиболее характерными элементами туберкулезного воспаления являются присутствие в препаратах эпителиоидных и гигантских клеток Пирогова—Лангханса (примерно у '/з больных). Эти элементы чаще выявляются при многократном исследовании мокроты.

Указанная выше цитологическая картина мокроты характерна премущественно для выраженных активных форм туберкулеза. При неактивном и менее выраженном туберкулезном процессе в легком мокрота не имеет специфических цитологических черт. В этих случаях обнаруживаются только клетки плоского эпителия, альвеолярные макрофаги и нейтрофилы, что не является специфичным для туберкулеза: такая картина может наблюдаться при различных процессах в легких и верхних дыхательных путях.

Метод цитологического исследования мокроты дает возможность выявить и элементы злокачественной опухоли, которые морфологически представляют собой малодифференцированные элементы с определенными цитологическими признаками, присущими клеткам злокачественной опухоли. В препаратах они определяются в виде значительных и малых конгломератов и очень четко выявляются на фоне компонентов мокроты. Лабораторная диагностика злокачественных новообразований не представляет особых трудностей для врачей-лаборантов, но определение вида опухоли далеко пе всегда возможно.

Адеиоматозный процесс в легких сопровождается наличием в мокроте клеточных структур, сходных с железистым и кубическим эпителием легкого. Структуры имеют своеобразную форму, располагаются в виде округлых образований с концентрическим расположением ядер или в виде неправильных форм.

Метод аспирационной биопсии легкого

При процессах, носящих диффузный характер, пункцию можно производить без предварительного прицельного обследования больного, но пунктировать следует участок легкого с наибольшей конгломерацией очагов, Пункцию очагов, расположенных и глубине легкого, особенно в прикорневой части, производить не рекомендуется, так как глубокие уколы представляют опасность для больного и ограничивают возможность попадания иглы в фокус.

Противопоказаниями к пункции являются:

  • 1) наклонность к кровотечениям;
  • 2) выраженная эмфизема;
  • 3) легочная и сердечная недостаточность I и II степени;
  • 4) гипертония малого круга;
  • 5) подозрение на иевризматическое образование.

Техника пункции. Как правило, эту манипуляцию осуществляют в рентгеновском кабинете под контролем рентгеноскопии. Во избежание газовой эмболии больной должен находиться н горизонтальном положении (на правом или левом боку, па спине или животе в зависимости от локализации патологического очага). Пункцию легкого производят по верхнему краю нижележащего ребра длинной иглой (10—12 см). Пглу вводят вместе с мандреном. Перед пункцией шприц и иглу кипятят, затем промывают спиртом и высушивают эфиром. После прокола грудной стенки и введения иглы в легкое удаляют мандрен, к игле присоединяют-10-граммовый шприц «Рекорд» и аспирируют материал. Насасыва-ние желательно производить не более 2—3 раз, при этом каждый раз шприц отъединять от иглы. При аспирации материала нельзя допускать обратных движений поршня в соединенном с иглой-шприце, так как это представляет опасность возникновения воздушной эмболии и потерю материала. После аспирации материала; шприц снимают с иглы, последнюю извлекают из легкого отдельно. Во время пункции больному рекомендуется более поверхностное.: дыхание.

Полученный материал выдувают на предметные стекла и размазывают шлифованным стеклышком. Препараты высушивают на. воздухе и окрашивают по гематологической методике, т. е. на нефиксированные препараты наливают краску Райта на 1 мин, затем, не сливая краски, добавляют равное количество дистиллированной, воды на 3 мин, промывают водой препарат и докрашивают в течение 10—15 мин раствором краски Романовского.

После пункции больного перекладывают на каталку и доставляют в палату. В течение суток он должен соблюдать постельный режим. При появлении кашля назначают кодеин или дионин, при болях — анальгетики.

При пункции легкого могут возникнуть осложнения в виде: незначительного кровохарканья и травматического пневмоторакса. По данным ряда авторов, травматический пневмоторакс наблюдался у 2—6% больных, кровохарканье при откашливании — у; 15%, но эти осложнения проходили через 2 дня.

Цитологический метод исследования имеет преимущество перед1 гистологическим в быстроте информации, возможности повторных, исследований и большей детализации клеток в связи с щадящим, фиксированием и окраской их.

На основании морфологического исследования пунктата можнс дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли, имитирующие туберкулез, внутригрудные опухоли (ганглионевромы симпатического ствола, актиномикоз), различные специфические и неспецифические диссеминации (эссенциальный гемосидероз, альвеолярный микролитиаз, метастазирующая аденома и др.).

Цитологическая картина пунктата легкого: в пунктаты попадают главным образом альвеолярные макрофаги и более мелкие альвеолярные клетки. Альвеолярные макрофаги — весьма крупные клетки с округлым, слегка бухтообразным ядром и обширной вакуолизированной протоплазмой. То, что представляется в виде вакуолей на фиксированных препаратах, является аппаратом фагоцитоза. При витальной окраске клеток видно, что в эти вакуоли быстро захватывается краска.

Реже, чем вакуоли пищеварения, встречаются вакуоли дегенерации. В свежих нефиксированных клетках они представлены в виде блестящих желтоватых капелек.

Альвеолярные макрофаги встречаются в большом количестве при многих патологических состояниях. Их величина и форма весьма разнообразны. Альвеолярные макрофаги связаны рядом промежуточных форм с другим, более мелким типом альвеолярных клеток, у которых ядро более компактно, а протоплазма значительно меньше по величине, резко базофильна и лишена вакуолей.

При воспалительных процессах большое количество мелких альвеолярных клеток попадает в пунктаты легкого. Иногда они лежат целыми пластами по типу эпителиальных клеток. Выраженная базофилия протоплазмы указывает па то, что это более молодые представители альвеолярных клеток.

В пуиктаты легкого, кроме того, попадают клетки бронхиального эпителия, представляющие собой сильно удлиненные клинообразные клетки, в центре которых расположено крупное вытянутое ядро с равномерным распределением хроматина. Протоплазма базо-фильная. Неизмененные клетки бронхиального эпителия содержат реснички, легко исчезающие при патологических процессах. Они окрашиваются в цвет азура (вишиево-красный). Около края протоплазмы, прилегающего к ресничкам, видны мелкие зерна, также красящиеся азуром.

При туберкулезе на фоне описанных выше клеток ясно выделяются лштелиоидные и гигантские клетки, а также творожистый распад.

При альвеолярном микролитиазе в пунктате выявляется значительное количество свободно лежащих бесцветных прозрачных кристаллов. Они отличаются от аморфных фосфатов при туберкулезе различной формой, величиной и располагаются на фоне эритроцитов и элементов легочной ткани. Природа этих Кристаллов в настоящее время не выяснена.

Пунктаты гапглионевромы характеризуются наличием клеток с круглым ядром и отросчатой формой протоплазмы, имеющей гомогенную структуру и окрашивающуюся в розовый цвет. Клетки гапглионевромы располагаются небольшими группами в мазках среди скудного количества эритроцитов. Клетки обычно соединяются между собой отростками. Картина пунктата гапглионевромы очень своеобразна. Характерно, что в препарате отсутствуют клетки легочной паренхимы.

Для метастазирующей аденомы щитовидной железы характерна картина однородных и одинаковой величины клеток, не обладающих признаками злокачественности. Элементы, как правило, располагаются в виде больших тканевых пластов. Между клетками иногда можно видеть скопление коллоида железы, представляющего собой гомогенную субстанцию в виде округлых образований розового цвета.

Цитологическое исследование материала катетербиопсии

В установлении истинной природы заболевания легких важное значение имеет цитология материала, полученного методом катетербиопсии. Метод основан на взятии материала непосредственно из очага поражения в легком специальным катетером. Процедура осуществляется во время поднаркозной бронхоскопии. Полученный материал представляет собой взвесь клеточных элементов в физиологическом растворе. Прежде чем подвергнуть его исследованию, содержимое пробирки предварительно центрифугируют и из осадка готовят мазки, которые высушивают па воздухе и окрашивают по Райту—Романовскому. Осадок по мере возможности обрабатывают весь.

При исследовании материала, полученного в случаях туберкулезного процесса, в препаратах чаще обнаруживают детрит типа казеозного с наличием нейтрофилов в стадии распада, а иногда с вкраплением солей извести. Эпителиоидные и гигантские клетки Пирогова—Лангханса выявляются редко.

Специфические элементы гранулемы (эпителиоидные клетки) располагаются преимущественно на фоне дегенеративно-измененного бронхиального эпителия, детрита, нейтрофилов и единичных альвеолярных макрофагов. Вместе с тем не следует забывать что эпителиоидные клетки в мазках катетербиопсии отмечаются и при саркоидозе легких. В этих случаях дифференцирование патологического процесса должно основываться на клинико-рентгенологиче-ской картине заболевания с учетом результатов лабораторного исследования. Для доброкачественной опухоли типа хондромы характерно наличие однородной структуры клеток с ядрами округлой формы без черт злокачественности. Клетки имеют небольшой ободок протоплазмы и располагаются среди соединительнотканной субстанции, окрашенной в интенсивный розовый цвет и имеющей волокнистое строение.

Диагностика злокачественных новообразований не представляет сложности для цитологов, так как морфология элементов новообразования весьма характерна. Затруднения могут возникнуть в тех случаях, когда материал получен из пограничных участков с опухолью, где при исследовании препаратов отмечается только метоплазма бронхиального эпителия, наблюдаемая также и при длительных воспалительных процессах в легком. Метаплазированный бронхиальной эпителий хотя и сохраняет реснитчатый аппарат, но отличается от нормального большими размерами, выраженными нуклеоламн и наличием крупной обильной зернистости в протоплазме.

Наиболее трудной для цитологов является диагностика пагнои-тельных воспалительных процессов. Это объясняется тем, что картина неспецифического воспаления, кроме хронической пневмонии, может иметь место и прн злокачественных новообразованиях легкого. В последних случаях наряду с элементами, характеризующими неспецифический воспалительный процесс в легком, т. е. нейтро-филами, альвеолярными макрофагами с резко вакуолизированной протоплазмой, в препаратах обнаруживается грубый детрит, окрашенный в темно-вишневый цвет, в котором нередко содержатся элементы новообразования. Грубый детрит является продуктом распада клеток опухолевой ткани. При дифференцировании неспецифических воспалительных процессов большое значение могут иметь результаты микробиологических исследований, которые дают возможность получать патогенную флору.

Мри лимфогранулематозе, адепоматозе цитологическая картииа идентична изменениям в мокроте.

Лабораторная диагностика неспецифической инфекции при туберкулезе

Лабораторная диагностика песпецифической инфекции основываема на результатах комплексного микроскопического и культу-ралыюго исследования патологического материала. Выбор патоло-гичеекого материала для исследования и строжайшее соблюдение правил его сбора и работы-с ним оказывают существенное влияние на результаты исследования. Обязательным является взятие материала in очага поражения с соблюдением правил асептики. Материал собирают в стерильную посуду и доставляют в лабораторию сразу же после сбора.

Материалом для исследования на неспецифнческую микрофлору могут служить:

  • 1) мокрота,
  • 2) мазки из зева,
  • 3) мазки слизи с надгортанника,
  • 4) мазкн из бронхов, полученные при бронхоскопии.
  • 5) промывные воды бронхов,
  • 6) мазки из ран и свищей,
  • 7) экссудат,
  • 8) гной,
  • 9) спинномозговая жидкость,
  • 10) кровь,
  • 11) моча, взятая обязательно катетером,
  • 12) ткань, полученная при биопсии пли во время операции,
  • 13) органы экспериментальных животных И др.

Бактериологическое исследование материала включает:

  • 1) бактериоскопическое исследование;
  • 2) культуральное исследование (метод посева) с выделением чистой культуры возбудителя;
  • 3) идентификацию выделенной культуры возбудителя (изучение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и других свойств) и определение патогенности выделенного микройа;
  • 4) определение лекарственной чувствительности выделенных микробов.

Мазки готовят на заранее обезжиренных предметных стеклах, высушивают при комнатной температуре и затем фиксируют путем медленного троекратного проведения препарата мазком кверху через пламя горелки. Фиксация жаром обязательна для проверки отношения бактерий к окраске по Граму; кроме того, фиксация убивает находящиеся на стекле бактерии и одновременно способствует приклеиванию их к стеклу. Фиксированные мазки окрашивают "по Граму. Окрашенные и высушенные мазки исследуют под микроскопом с иммерсионным объективом при полностью открытой диафрагме и с поднятым до уровня предметного столика конденсором.

Культуральное исследование. Все посевы на неспецифическую микрофлору, за исключением посевов мокроты, производят без какой-либо предварительной обработки патологического материала. Первичный посев производят одновременно на плотные (мясо-пептонный агар —МПА и 5% кровяной агар) и жидкие (мясо-пептонный бульон — МПБ; сахарный мясо-пептонный бульон — сахарный МПБ, или сывороточный бульон, или среда Тароцци) питательные среды. Одновременное применение жидких и плотных сред, равно как и сред обычного состава и обогащенных, обусловливается тем, что разные виды микроорганизмов по разному относятся к этим средам и обладают различной способностью роста на них.

Посев различного патологического материала имеет ряд особенностей.

Мокрота. Основной задачей при исследовании мокроты является дифференциация микрофлоры бронхов и легочных альвеол (истинных возбудителей патологического процесса) от микрофлоры, постоянно или периодически находящейся в ротовой полости и прилегающих к ней отделах верхних дыхательных путей. С целью максимальной очистки гнойного комочка мокроты от наслоившихся на него обитателей верхних дыхательных путей и ротовой полости применяют методы механической очистки и методы количественного разведения.

Из методов механической очистки наибольшее признание получила модифицированная обработка мокроты по Коху—Китазато. Мокроту выливают в чашку Петри, под которую подложен листок черной бумаги. Отчетливо выступающие на черном фоне гнойные комочки мокроты (в количестве 3—4) с помощью стерильных запаянных на концах и слегка загнутых пастеровских пипеток последовательно переносят в стоящие рядом 2—3 чашки Петри со стерильным физиологическим раствором и механически отмывают (прополаскивают) в них. Из последней чашки производят посев на серию питательных сред.

Методы количественного разведения основаны на положении, что микроорганизмы, вызывающие неспецифическое воспаление легких, присутствуют в мокроте в значительно большем количестве, чем микроорганизмы, поверхностно загрязняющие мокроту при прохождении ее через глотку и ротовую полость. Поэтому путем культивирования правильно подобранного разведения мокроты можно выделить в чистой или почти чистой культуре именно тот микроорганизм, который играет этиологическую роль.

При посеве количественным методом мокроту тщательно гомогенизируют в банке с битым стеклом или бусами и готовят из нее последовательные десятикратные разведения до 10-6. Затем 0,1 мл разведенной таким образом мокроты засевают на поверхность кровяного агара в чашке Петри и равномерно распределяют по всей поверхности шпателем. При посеве шпателем материал слегка втирают в среду, стараясь не повредить ее целостности. Кроме того, мокроту засевают также на поверхность скошенного МПА, на пробирку с МПБ и с сахарным МПБ.

Мазки из зева, с надгортанника и из бронхов засевают на питательные среды в следующем порядке:

  • 1) в пробирку с МПБ и
  • 2) в пробирку с сахарным МПБ (этим достигаются посев и одновременное смачивание тампона),
  • 3) в пробирку со скошенным МПА, слегка втирая в его поверхность,
  • 4) на чашку Петри с 5% кровяным агаром — посев штрихом по всей поверхности.

Промывные воды бронхов. При наличии комочков слизи последние засевают на питательные среды без предварительного промывания. При отсутствии видимых невооруженным глазом комочков материал набирают пипеткой и засевают на все указанные выше среды.

Мазки из ран и свищей засевают аналогично мазкам из зева.

Экссудат и гной засевают на пробирки с МПА, МПБ и сахарным МПБ.

Спинномозговую жидкость исследуют сразу же после доставки ее в лабораторию. Задержка исследования неблагоприятно отражается на его результатах. Если жидкость прозрачна, ее центрифугируют и для посева используют осадок. При мутной жидкости центрифугирование излишне. Посев производят на все указанные выше питательные среды. Остатки спинномозговой жидкости помещают п термостат и выдерживают в нем в течение 24 ч, мог-а- чего материал засевают повторно, так как спинномозговая жидкость является хорошей питательной средой.

Ткань, полученную при бронхоскопии или во время операции, и органы экспериментальных животных помещают в стерильную ступку, где тщательно измельчают. Затем в ступку наливают стерильный физиологический раствор или МПБ и, тщательно обмыв им измельченную ткань, засевают эту жидкость на все указанные выше среды.

По окончании посева приготавливают предварительный мазок. Па засеянные патологическим материалом чашки раскладывают стандартные диски, пропитанные антибиотиками, с целью ориентировочного определения чувствительности микрофлоры.

При посевах патологического материала необходимо:

  • 1) по возможности использовать весь жидкий патологический материал. В том случае, если материала много, для посева следует использовать как осадок, так и надосадочную жидкость;
  • 2) во избежание загрязнения исследуемого материала предварительный мазок на нестерильных предметных стеклах делают по окончании посева;
  • 3) по окончании посева все пробирки и чашки, на которые- сделан посев, помещают на 1 сут в термостат при 37°. Чашки Петри укладывают в термостат вверх дном, чтобы скапливающаяся на крышке конденсационная жидкость не размыла посев;
  • 4) посев на неспецифическую микрофлору просматривают ежесуточно;
  • 5) при отсутствии макроскопически видимого роста посевы в пробирках выдерживают в термостате в течение 3 сут, посевы на чашках Петри — в течение 1—2 сут, посевы крови — в течение 5—10 сут (при ежесуточном просмотре и взбалтывании для усиления аэрирования);
  • 6) по истечении 3 сут все посевы без роста (кроме Посевов крови) дают отрицательный ответ.

В том случае, если на 2-е или 3-й сутки на питательных средах (плотных или жидких или тех и других одновременно) появляется макроскопически видимый рост микроорганизмов, дальнейшее исследование проводят с целью:

  • а) наиболее полного выделения чистых культур всех выросших микробных видов;
  • б) идентификации всех выделенных культур микроорганизмов на основании изучения их морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и других свойств;
  • в) определения патогенности выделенных микроорганизмов.

Определение чувствительности микробов к антибиотикам. Для определения лекарственной чувствительности микроорганизмов применяют методы диффузии в агар и методы серийных разведений.

При методе диффузии на поверхность агара, засеянного испытуемыми микробами, помещают бумажные диски, пропитанные антибиотиками. Количество антибиотика на диске устанавливают в зависимости от абсолютной активности препарата и скорости его диффузии в среду, а также достигаемых in vivo терапевтических концентраций препарата в организме при различных инфекциях. В практических лабораториях рекомендуется пользоваться выпускаемыми отечественной промышленностью (Московский завод медицинских препаратов № 2) стандартными дисками.

Метод диффузии в агар при соблюдении стандартных условий обладает достаточной точностью.

Лабораторная диагностика кандидоза и аспергиллеза

Практическое значение в клинике туберкулеза имеет лабораторная диагностика дрожжеподобных и плесневых грибов.

Лабораторная диагностика грибковых поражений основывается на результатах комплексного микроскопического и культурального исследования патологического материала, на определении истинной природы возбудителя (морфологические, тинкториальные, биохимические, антигенные и другие свойства), на результатах серологических и аллергических реакций.

Обязательным для успешного исследования является взятие материала именно из очага поражения и в асептических условиях.

Кандидоз. При подозрении на микоз необходимо микроскопическое исследование патологического материала. Микроскопируют неокрашенные и окрашенные препараты.

Нативные препараты из жидкого патологического материала готовят без дополнительной обработки: каплю материала помещают на предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют. Более густой материал мацерируют 12 каплями 10% едкой щелочи или смесь спирта, глицерина и воды (2:2:4), или раствором Люголя.

Исследование проводят сначала с малым, затем с большим увеличением.

Обнаружение псевдомицелия или круглых и удлиненных почкующихся дрожжевых клеток считается существенным и обязательно отмечается.

Кроме того, микроскопируют окрашенные препараты. Препараты, фиксированные над пламенем горелки или смесью спирта с эфиром, окрашивают по Граму, по Романовскому—Гимзе, метиленовым синим. Окрашенные препараты микроскопируют с иммерсионным объективом. При окраске по Граму клетки дрожжеподобных грибов и нити мицелия представляются интенсивно окрашенными в темно-фиолетовый цвет, при окраске по Романовскому—Гимзе цвет клеток розовато-фиолетовый.

Микроскопическое исследование патологического материала следует проводить повторно обязательно с учетом среднего количества дрожжеподобных клеток на 50—100 нолей зрения. Нарастание количества клеток дрожжеподобных грибов при повторном исследовании является показателем их активности в процессе болезни.

Находки дрожжеподобных грибов при микроскопии патологического материала из открытых очагов поражения не имеют решающею диагностического значения и нуждаются в подтверждении их «тнплпгпчсскоЛ роли культуряльиым и серологическими методами и данными аллергических проб.

Материал засевают на различные питательные среды. Наиболее подходящими из них являются среда Сабуро, пивное сусло, сусло-агар, мясо-пептонный глю-коэпый агар и др.

Во избежание микробного загрязнения посевов иеспецифиче-ской микрофлорой к питательной среде рекомендуется добавлять смесь пенициллина со стрептомицином из расчета 100 ЕД каждого антибиотика па 1 мл среды.

Материал засевают на 2 чашки Петри с плотной средой и 2 пробирки с плотной и жидкой питательной средой.

При посеве на Candida обязательным является проведение количественного учета. С этой целью на каждую чашку наносят пинеткой по 0,1 мл предварительно тщательно гомогенизированного материала и стеклянным шпателем равномерно распределяют его по всей поверхности. Инкубация в термостате при 37°.

В положительных случаях на 2—3-й сутки подсчитывают среднее арифметическое число колоний, выросших на 2 чашках, и пересчитывают их содержание на 1 мл патологического материала.

При посеве мазков слизи из ротовой полости или материала, взятого из ран на тампоны, тампон или мазок тщательно отмывают в 10 мл жидкой среды Сабуро или стерильного физиологического раствора и затем засевают на 2 чашки Петой с плотной средой по 0,1 мл. Количество выросших колоний пересчитывают на мазок. На 2—3-й сутки колонии выглядят обычно блестящими, куполообразными, затем они увеличиваются в размерах, могут сливаться друг с другом, нередко дают ветвящиеся отростки в субстрат. В случае обильного роста, когда подсчет числа колоний на чашке невозможен, рекомендуются повторные посевы материала, разведенного стерильным физиологическим раствором в 50, 100, 200 раз и т. д.

При замедленном росте или отсутствии его для окончательного ответа посевы выдерживают в термостате в течение 10—15 сут.

Подозрительные на дрожжеподобные грибы колонии исследуют микроскопически в неокрашенных препаратах или мазках, окрашенных по Граму, метиленовым синим и т. д.

Идентификацию дрожжеподобных грибов осуществляют путем изучения их роста (сметанообразный или пленчатый), строения (дрожжевые почкующиеся клетки), морфологических типов роста (вертициллы, гломерулы), выявления хламидоспор и псевдомицелия. В процессе дифференциации выделенных культур от истинных дрожжей необходимо иметь в виду, что дрожжеподобные грибы (в отличие от истинных дрожжей) не имеют аскоспор и истинного мицелия, они образуют псевдомицелий с вертициллами, гломеру-лами и хламидоспорами (С. albicans).

Видовую принадлежность выделенного штамма гриба определяют на основании изучения морфологических типов роста и биохимической активности (ферментация и усвоение углеводов, усвоение азотистых веществ). Изучение ферментации Сахаров дает весьма демонстративные результаты (табл. 1).

Ферментация сахаров

Для выявления аскоспор культуры засевают на специальную среду Городковой и выдерживают в термостате при 25—30° в течение 15 дней, неоднократно микроскопируя в течение этого периода неокрашенные и окрашенные но Цилю—Нильсену препараты. Отсутствие округлых клеток (асков) со спорами свидетельствует о принадлежности изучаемого штамма к дрожжеподобным грибам.

Для выявления филаментации и ее характера делают штриховые посевы на голодный агар (картофельный, мучной, морковно-картофельный) в чашках Петри или пробирках. Филаментацию просматривают через 3—7 сут с обратной стороны чашки под малым увеличением микроскопа при опущенном конденсоре. При просмотре регистрируют характер филаментацин, наличие или отсутствие хламидоспор, вертициллы, гломерулы.

Патогенность выделенных культур проверяют на мышах (внутрибрюшинное заражение) и кроликах (внутривенное заражение).

Серологическую диагностику кандндозов осуществляют посредством постановки реакции агглютинации и связывания комплемента-

Методика и схема постановки этих реакций такие же, как при постановке реакций с микробными антигенами.

Реакция агглютинации (РА) довольно чувствительна, но специфичность ее при кандидозах недостаточна, так как при небольших разведениях сыворотки (1 : 40, 1 : 80 и даже 1 : 160) она может быть положительной и у здоровых носителей Candida. Достоверной считается только резко положительная реакция при разведении сыворотки 1 : 200 и больше. Диагностическое значение при кандидозе РА имеет только при наличии динамического нарастания титра агглютининов в процессе болезни.

Реакцию связывания комплемента (РСК) ставят аналогично реакции Вассермана. РСК более специфична, чем РА, и дает более достоверные результаты.

Аспергиллез. В настоящий момент описано в общей сложности около 300 видов аспергилл. Большинство из них являются сапро-фитами. По данным различных авторов, число патогенных видов колеблется от 13 до 30.

Наиболее частым возбудителем аспергиллеза человека и жи-потпых является A. fumlgatus. Следующим является A. niger. Заболевания, вызванные A. clavatus, A. llavus и пр., описаны как спорадические случаи.

Не всегда попадание аспергилл в организм человека вызывает у него болезненный процесс.



Широкое распространение плесневых грибов в окружающей среде и возможность их сапрофитирования в организме больного грсбуют не только выделения гриба, но и строгого доказательства его апологической роли. В пользу аспергиллезной этиологии процесса говорит пакоиомерные находки гриба в очаге поражения.

Выделение аспергилл из резекционного материала (непосредственно из очага поражения) также может служить доказательст-пом аспергиллеза. Однако это не исключает возможности наличия аругих патологических процессов, например ракового стеноза, который может создавать предпосылки для развития аспергиллезной инфекции.

Культуральное исследование на аспергиллез предусматривает ряд технических особенностей, дающих микологу уверенность в правильности получаемого результата. К таким особенностям относятся:

  • 1)    обязательное тщательное исследование нативного мазка;
  • 2)    контроль воздушной среды лаборатории во время посева;
  • 3)    учет интенсивности роста;
  • 4)    специальная техника посева на питательные среды.

Посев на плесневые грибы обязательно сопровождается контролем воздуха: во время посева рядом с двумя засеваемыми чашками со средой Сабуро ставят открытую чашку Петри с той же средой. По окончании посева ее закрывают и инкубируют вместе с засеянными. Эта чашка контролирует стерильность воздуха лаборатории во время посева и гарантирует от ошибочных заключений, если воздух лаборатории загрязнен спорами плесневых грибов. При посеве материала на чашки его не распределяют по всей поверхности, как принято в бактериологической практике, а наносят в различные участки по каплям, чтобы в последующем было видно, что рост идет именно из патологического материала. В качестве питательной среды для первичного выделения используют среду Сабуро или сусло-агар с добавлением антибиотиков (100 ЕД пенициллина и 100 ЕД стрептомицина па 1 мл среды).

Патологический материал засевают дознрованно с тем, чтобы произвести количественный учет гриба и в дальнейшем следить за динамикой его выделения из организма. Посевы инкубируют в термостате при 37° в течение 2—7 сут и ежедневно просматривают.

Затем из отдельной изолированной колонии получают чистую культуру гриба и в висячей капле и на блоках с различными средами изучают процесс его развития, пигментно- и спорообразование, на основании чего определяют род, а если возможно, то и вид гриба. Оптимальной средой для идентификации выделенных плесневых грибов является среда Чапека.

Для определения вида каждый выделенный гриб высевают в отдельную чашку Петри с агаром Чапека. Посевы делают уколами (до 8—10), не возобновляя споровой нагрузки. Первое наблюдение производят через 3—4 дня, а затем с такими же интервалами — всего до 15 дней, в редких случаях дольше. При каждом наблюдении отмечают свойства изучаемых штаммов: размеры колоний, их внешний вид, цвет как с верхней, так и с нижней стороны, окраску субстрата, строение растущего края и т. д.